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QIAGEN試劑盒容易被人忽視的細(xì)節(jié)
更新時(shí)間:2016-11-26   點(diǎn)擊次數(shù):3345次
   QIAGEN試劑盒應(yīng)用過(guò)程中,有些小細(xì)節(jié)容易被人們忽視,從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體是哪些小細(xì)節(jié)呢?小編整理如下。

  1、QIAGEN試劑盒抗體濃度須優(yōu)化

  我們通常會(huì)follow師兄師姐留下來(lái)的操作步驟,但是如果試劑稍有不同,則可能需要優(yōu)化抗體的量。記住,非特異的抗體結(jié)合會(huì)增加背景。為了防止這一點(diǎn),切勿使用過(guò)多的一抗或二抗。

  2、QIAGEN試劑盒洗滌很關(guān)鍵

  QIAGEN試劑盒洗滌步驟看似很無(wú)聊,其實(shí)很重要,因?yàn)槿绻唇Y(jié)合的材料(如非特異結(jié)合的抗體或檢測(cè)試劑)殘留在微孔板中,那么它會(huì)增加背景噪音。如有必要,可增加洗滌液中的鹽濃度,這會(huì)阻止非特異結(jié)合反應(yīng)。如果ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)背景過(guò)高,而您懷疑洗滌不夠時(shí),可以嘗試增加洗滌次數(shù)。

  3、QIAGEN試劑盒特異性因素

  1.固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種,以微量滴定板zui為常見(jiàn)。

  2.包被物的純度。在酶聯(lián)免疫測(cè)定尤其是間接ELISA中,試劑的特異性取決于使用抗原的純度。

  3.包被抗體的效價(jià)。具有高親和力和高特異性的包被抗體,是決定試劑特異性的重要方面。

  4.封閉。是ELISA中重要的一步,目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙,減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾。

  4、QIAGEN試劑盒實(shí)驗(yàn)封閉很重要

  封閉液的作用是讓不相關(guān)的蛋白占據(jù)微孔板中潛在的結(jié)合位點(diǎn)。這就降低了可產(chǎn)生信號(hào)的抗體非特異結(jié)合的機(jī)會(huì)。您當(dāng)然也希望抗體只與目的蛋白結(jié)合吧。如果您的背景過(guò)高,懷疑封閉不充分,那么您可以嘗試使用更高濃度的封閉液,或適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間。

  如果您一直被背景問(wèn)題所困擾,那么也許您該花些時(shí)間來(lái)優(yōu)化封閉液。這可能需要時(shí)間,但也是值得的。目前主要有兩種類型的封閉液:蛋白和非離子型去污劑。您使用的類型須取決于多個(gè)因素,包括微孔板的表面試劑、吸附的抗原、您的抗體和檢測(cè)試劑。好的封閉液應(yīng)降低非特異性結(jié)合,但它不應(yīng)當(dāng)與抗原、抗體或檢測(cè)試劑發(fā)生相互作用。zui常用的非離子型去污劑是Tween-20。這種封閉液便宜、穩(wěn)定,在去除洗滌過(guò)程中的一些非特異結(jié)合上很有用。但它們只在存在時(shí)起作用,因?yàn)楹苋菀妆幌吹簟R虼怂邢礈煲褐幸脖仨毺砑臃忾]液。請(qǐng)勿使用高濃度(正常濃度為0.01-0.1%),它會(huì)降低特異結(jié)合,產(chǎn)生假陰性。另一個(gè)選擇是使用蛋白和非離子型去污劑這兩種封閉液,后者可協(xié)助洗滌過(guò)程中的封閉。

  蛋白封閉液則有所不同,是*的。它們與開(kāi)放位點(diǎn)結(jié)合并封閉,同時(shí)穩(wěn)定與微孔板結(jié)合的抗原分子。常用的蛋白封閉液包括牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、正常血清和魚(yú)明膠。血清組分的內(nèi)在多樣性可使它有效攔截許多不同類型的分子相互作用。不過(guò),它的缺點(diǎn)在于能與Protein A和IgG抗體相互作用。解決這個(gè)問(wèn)題的一種方法是使用雞或魚(yú)的正常血清。

  5、QIAGEN試劑盒檢測(cè)試劑要適量

  另一點(diǎn)也很顯而易見(jiàn):切勿使用過(guò)多的檢測(cè)試劑。如果濃度過(guò)高,或者未正確稀釋,則會(huì)導(dǎo)致高背景。也不要顯色過(guò)度,如有必要,優(yōu)化一下何時(shí)應(yīng)加入終止液。

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