Qiagen試劑盒提取總RNA的操作過程:
1、稱取新鮮葉組織樣品100 mg,液氮速凍。
2、在預冷的研缽中研磨成細粉,轉移到2 ml離心管中。注意研磨不*則會造成嚴重產量降低。
3、待液氮揮發(但不能解凍)后,加入450 ml提取緩沖液RLT,渦旋混勻,并在56℃溫育1~3 min。注意:在RLT臨用前加入1/100體積的14.5 M β-巰基乙醇,加后保存時間不超過1個月,RLT溶液應在1個月內使用。對于高淀粉含量的材料,可將溫度提高到60℃以上防止淀粉結塊。
4、將裂解液加到離心柱(淺紫色柱)上,下接一個2 ml收集管,zui大轉速離心2 min。如果將裂解液粘稠,可切去吸頭頂端,用大口吸頭吸取。裂解液通過柱子時被均質化,大部分組織碎片都被截留在柱子表面,只有少部分通過柱子形成沉淀,因此,應小心吸取上清液,轉移到另一新離心管,不要吸細胞碎片殘渣沉淀。
5、加入0.5倍體積(225 µL)96~100%乙醇,吹打混合均勻。如果裂解液有損失,則相應減少乙醇用量。加入乙醇后,可能會出現沉淀,但對提取無影響。
6、將混合液全部(包括沉淀675 µL)轉移到吸附RNA的離心柱(粉紅色柱),下接一個2 ml收集管,大于8000 g或10000 r/min離心15 sec。如果混合液體積超過700 µL,每次只加700 µL到離心柱上,按上述條件離心。棄去管內液體,重復使用收集管。
7、加入700 µL洗脫液,大于8000 g或10000 r/min離心25 sec,棄去收集管。
8、將離心柱轉移到一新的2 ml收集管上,加入500 µL RPE液,大于8000 g或10000 r/min離心15 sec。棄去管內液體,重復使用收集管。注意:Qiagen試劑盒提供濃縮的PRE洗脫液,所心使用前必須加入4倍體積的96~100%乙醇,成為工作液。
9、加入500 µL RPE液到離心柱上,zui大轉速離心2 min,干燥離心柱,棄去收集管。殘留乙醇會干擾隨后的反應,這次離心要保證無乙醇殘留。若有乙醇殘留,以zui大轉速離心1 min。
10、把離心柱連接到一新的1.5 ml收集管上,加入20~30 µL 無RNase水,大于8000 g或10000 r/min離心1 min,洗脫RNA。若RNA產量在20 μg以上,用30~50 µL無RNase水再洗脫一次。RNA樣品存于-20℃或-80℃冰箱。
11、分光光度計測定RNA。開啟紫外分光光度計,預熱30 min。用DEPC處理水校正零點。用DEPC處理水稀釋RNA樣品30~50倍,將稀釋液轉移到比色杯中。讀取230、260、280、310 nm的OD值。計算出樣品濃度和OD比值。OD260/ OD280比值應為1.7~2.1,低于1.7,說明有蛋白質或酚污染;OD260/ OD230比值應大于2,低于此值,說明有糖、鹽、胍等小分子污染。
12、瓊脂糖凝膠甲醛變性電泳。首先制備凝膠(1.2%)。稱取1.2 g瓊脂糖,加72 ml DEPC處理的水,加熱溶化。冷卻至60℃,在通風櫥內加入10×凝膠緩沖液10 ml,甲醛(37%)18 ml,混勻后倒膠。然后制備樣品。在離心管中,將RNA樣品與5×變性上樣緩沖液按4:1比例混勻。65℃溫育5~10 min,迅速在冰上冷卻5 min,瞬時離心數秒。上樣前凝膠須預電泳5 min,隨后將樣品加入上樣孔。以5 V/cm電壓電泳1.5~2 hr。待溴酚藍遷移至凝膠長度的2/3~4/5處結束電泳。將凝膠置于溴化乙錠溶液(0.5 µg/mL,用0.1 mol/L乙酸胺配制)中當色約30 min。紫外燈下觀察結果。
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