天凈沙 可調式易錯 PCR 試劑盒
211216-100 天凈沙 可調式易錯 PCR 試劑盒，產品簡介：產品品牌：天凈沙產品名稱：可調式易錯 PCR 試劑盒產品貨號：211216-100產品規格：100次
天凈沙211216-100可調式易錯 PCR 試劑盒
北京天凈沙基因科技有限公司，是一家聚焦科研試劑、動物檢驗檢疫、分子診斷的研發和生產企業。自創建以來，公司秉承“因為全在心上，所以不在話下"的經營理念，堅持把核心技術放在心上、把產品質量放在心上、把用戶服務放在心上的三項原則，讓所有困難都不在話下。
我們北京諾博萊德科技有限公司作為天凈沙公司的特約經銷商為客戶提供，保證原裝正品，貨期穩定，折扣好的服務標準。
211216-100 天凈沙 可調式易錯 PCR 試劑盒，產品簡介：
產品品牌：天凈沙
產品名稱：可調式易錯 PCR 試劑盒
產品貨號：211216-100
產品規格：100次
211216-100 天凈沙 可調式易錯 PCR 試劑盒
產品及特點
易錯PCR（Error-prone PCR）是利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校對功能的特性，在一定條件下（如不同的dNTP濃度、Mg濃度和MnCl2存在）能夠按較高的機率引入隨機引入突變。如果有適當的選擇方法，則可從構建的突變庫選出所需突變體。本產品是在本公司的易錯PCR試劑盒的基礎上改進而得，本
產品具有下列特點：
1. 即開即用，十分簡單方便，尤其在生物制藥和酶學研究領域顯示出了它的*性。
2. 配方經過精心優化，實驗人員在一定范圍內可以控制突變率，一輪PCR的突變率范圍在2-8突變/1000bp，更高的突變率可以通過多輪PCR達到。
3. 可用于連續易錯PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次易錯PCR的產物用作下一次易錯PCR的模板即可，使每一次獲得的小突變累積而產生重要的有益突變。
4. 可以擴增的DNA片段更長，達到2kb，對于2kb以上的產物，建議分段擴增。
5. 本試劑盒足夠100次30uL體系的易錯PCR。
6. 本產品只能用于科研。
規格及成分
本產品采用五孔盒包裝
成份 | 編號 | 規格 | 包裝材料 |
可調易錯PCR專用 Taq DNA聚合酶（5U/uL） | 101005c | 50 uL | 0.5mL紅蓋管 |
5×可調易錯PCR Mix（含dNTP | 211216a | 600 uL | 0.5mL黃蓋管 |
可調易錯PCR專用MnCl2 | 211216c | 300 uL | 0.5mL紫蓋管 |
可調易錯PCR專用dGTP | 211216d | 300 uL | 0.5mL藍蓋管 |
10×可調易錯PCR追加dNTP | 211216e | 300 uL | 0.5mL本色管 |
使用手冊 | 211216sc | 1份 | 無 |
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存, 有效期為一年
自備試劑
引物、DNA模板、常規PCR試劑盒
使用方法
1. 將引物稀釋到10uM。引物也是決定易錯PCR成敗的關鍵因素，設計引物時要保證其Tm在70℃，長度在25-30nt之間，GC含量在45%-60%之間，3端GC含量低，并且沒有發夾結構。
2. 用自備易錯PCR引物和自備的常規PCR試劑擴增制備易錯DNA模板（常規PCR產物），膠回收并準確確定濃度。注意：易錯PCR的模板一定要用膠回收的常規PCR產物，因為膠回收會可以把電泳不可見的非特異性擴增片段去除，否則這些片段由于也是用易錯PCR引物擴增所得，在易錯PCR擴增時也會被擴增，產生競爭抑制，降低靶分子的擴增效率。
3. 將回收的DNA片段（模板）稀釋到1ng/uL 、10ng/uL和100ng/uL三個濃度。注意：模板使用量是影響突變率的最重要因素，模板DNA為非突變DNA，擴增產生的DNA為突變DNA，易錯PCR體系最終DNA量是基本固定的，因此模板DNA使用量越大，則突變DNA在終產物中的相對比例就越低，突變率就越低。故建議同時測試三個模板用量。如果都成功，則優先選用模板濃度低的PCR產物進行分析。
4. 根據每1000bp的預期突變數按下表確定30uL易錯PCR體系中MnCl2和dGTP的用量（這是在模板DNA不超過1ng的前提下的數據）。表中的Mn表示可調易錯PCR專用的MnCl2, dG表示可調易錯PCR專用的dGTP：
預期突變數 | 2個 | 3個 | 4個 | 5個 | 6個 | 7個 | 8個 |
Mn用量（uL） | 0 | 1.0 | 2.5 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
dG用量（uL） | 0 | 0 | 0 | 1.0 | 2.0 | 3.0 | 4.0 |
5. 設置30uL體系的可調易錯PCR：第一次建議設置3個模板濃度。在3干凈的PCR管中，分別加入下列成分。最后加可調易錯PCR專用MnCl2
成分 | 模板用量1 | 模板用量2 | 模板用量3 |
可調易錯PCR Mix, 5× | 6 uL | 6 uL | 6 uL |
可調易錯PCR 專用dGTP | 根據上步用量表表選擇 | 根據上步用量表表選擇 | 根據上步用量表表選擇 |
自備DNA模板 | 1 uL （1ng/uL） | 1 uL （1ng/uL） | 1 uL （1ng/uL） |
自備PCR引物 (10 uM each) | 1 uL each | 1 uL each | 1 uL each |
可調易錯PCR專用 Taq DNA聚合酶 | 0.5 uL | 0.5 uL | 0.5 uL |
可調易錯PCR 專用MnCl2 | 根據上步用量表表選擇 | 根據上步用量表表選擇 | 根據上步用量表表選擇 |
自備超純水 | 補水到30uL | 補水到30uL | 補水到30uL |
6. 按已經優化的常規PCR條件進行易錯PCR：
PCR前變性 | 94℃ 3分鐘 |
易錯PCR(循環30-60次 | 94℃ 1分鐘 |
60℃ 1分鐘 | |
72℃ 3-10分鐘 |
注：由于易錯PCR含高濃度的鎂離子，因此容易形成引物二聚體，因此需要使用較高的復性溫度，以避免小片段擴增產物競爭性抑制PCR。易錯PCR一般不需要熱啟動，也不需要在易錯PCR結束后做延伸處理。易錯PCR循環次數越多，突變DNA（擴增產物）與非突變DNA（原始模板）的比例就越高。此外在突變率和模板長度恒定的情況下，擴增次數越多，發生突變的絕對數就越高，在同一模板上發生的突變位點數就越多，所以如果需要，可以做30、35、40、45、50、55、60次7個循環數的比較
7. 易錯PCR結束后，取3uL進行電泳檢查。
8. 如果有預期大小的PCR產物，則全部電泳，進行膠回收，再進行克隆和測序等后續操作。如果需要增加突變率，可以選擇一個突變后的DNA為模板，再進行下一輪易錯PCR。
9. 如果沒有預期大小的PCR產物，可以按下列操作追加進行一輪常規PCR（追加PCR）。
10. 在PCR管中，加入3uL 10×可調易錯PCR專用追加dNTP到27uL電泳剩下的PCR體系中，按下表進行追加PCR（chasing PCR）。注意追加PCR只做20次循環。
步驟 | 參數 | 循環數 |
追加PCR | 94℃ 1分鐘 | 循環20次 |
60℃ 1分鐘 | ||
72℃ 1分鐘 |
11. 追加PCR結束后，再電泳檢測。如果有條帶，再進行克隆和測序等后續操作。如果需要增加突變率，可以選擇一個突變后的DNA為模板，再進行下一輪易錯PCR。
12. 如果沒有預期大小的PCR產物，則需要分析原因
疑難解答
Q：現象：沒有PCR產物。
A：可能原因：一是引物沒有優化，可以重新設計引物；二是模板DNA太少，可以增加用量；三是模板不純，最好先膠回收；四是DNA溶液中有EDTA，可以適當補加Mg++。
Q：現象：太多的PCR條帶或PCR條帶模糊一片。
A：可能原因：一是模板有膠回收、二是PCR循環數太多；三是復性溫度太低；四是引物沒有優化；五是PCR條件沒優化，可以使用touch-down PCR。
Q: 如果需要更高的突變率，如何辦？
A: 可以使用連續多次易錯PCR來提高突變率。但最好先用膠純化回收易錯PCR片段,再用于下一輪易錯PCR。
關聯產品
易錯PCR試劑盒
