NobleRyder RIPA裂解液(中)
NobleRyder RIPA裂解液(中) 即用型液體試劑 P4812-100ml
RIPA裂解液(中)
產(chǎn)品簡介:
多種成分均可以從細(xì)胞中提取總蛋白,如Triton、SDS、NP-40等。RIPA裂解液(中)(RIPA Lysis Buffer)是采用一種經(jīng)典的細(xì)胞組織快速裂解并獲得總蛋白的裂解液,其裂解強(qiáng)度大于NP-40裂解液、RIPA裂解液(弱)。所獲得的蛋白質(zhì)可用于Western,免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)等。
Medium RIPA Lysis Buffer主要由Tris 、NP-40、sodium deoxycholate等組成,并含有多種蛋白酶抑制劑成分,可以有效抑制蛋白的降解,并維持原有的蛋白間相互作用。
NobleRyder RIPA裂解液(中)
產(chǎn)品組成:
編號 名稱 | P4812 | Storage |
Medium RIPA Lysis Buffer | 100ml | -20℃ |
PMSF(100mM) | 1.5ml | -20℃ |
使用說明書 | 1份 |
操作步驟(僅供參考):
(一)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞
1.取Medium RIPA Lysis Buffer置室溫溶解混勻,加入PMSF,使PMSF終濃度為1mM。
2.去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液,用PBS、NS或無血清培養(yǎng)液清洗1次,低速離心,棄上清,留取沉淀。
3.按照6孔板每孔加入150~250μl含有PMSF的裂解液的比例,加入Medium RIPA Lysis Buffer 。移液器輕輕吹打,使裂解液和細(xì)胞充分接觸。置于冰上或4℃裂解15~30min,通常裂解液作用于細(xì)胞1~3秒內(nèi),細(xì)胞就會被裂解。通常6孔板每4.孔細(xì)胞加入100μl解液已經(jīng)足夠,如果細(xì)胞密度很高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200~250μl。
5.10000~12000g,4℃離心5~10min(如無低溫離心機(jī),室溫下離心亦可),取上清。
6.進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞
1.取Medium RIPA Lysis Buffer 置室溫溶解混勻,加入PMSF,使PMSF終濃度為1mM。
2.低速離心懸浮細(xì)胞,棄上清,收集沉淀。
3.用手指輕彈細(xì)胞,使其松散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150~250μl含有PMSF的裂解液的比例,加入Medium RIPA Lysis Buffer 。通常6孔板每孔細(xì)胞加入150μl裂解液已經(jīng)足夠,但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200~4.250μl。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞,充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。
5.10000~12000g,4℃離心5~10min(如無低溫離心機(jī),室溫下離心亦可),取上清。
6.進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(三)組織樣本
1.取Medium RIPA Lysis Buffer 置室溫溶解混勻,加入PMSF,使PMSF終濃度為1mM。
2.把組織jian切成細(xì)小的碎片,越小越好。
3.取在液氮或超低溫冰箱中冷凍30min以上的組織,迅速用液氮研磨,研磨過程盡量控制在1~2min之內(nèi),以減少蛋白的降解。
4.按照每20mg組織加入150~250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解15~30min。
5.步驟3、4亦可以采用如下過程:按照每20mg組織加入150~250μl裂解液的比例,加入含有PMSF的Medium RIPA Lysis Buffer。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿,直至充分裂解,該過程盡量控制在1~2min之內(nèi),以減少蛋白的降解。
6.10000~12000g,4℃離心5~10min(如無低溫離心機(jī),室溫下離心亦可),取上清。
7.進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
注意事項:
1.去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液后,如果血清中的蛋白沒有干擾,可以不用清洗。
2.如果裂解不充分可以適當(dāng)增加裂解液的用量,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當(dāng)減少裂解液的用量。
3.如果細(xì)胞量較多,必需分裝成50~100萬細(xì)胞/離心管,然后再裂解。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分,而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸,相對比較容易裂解充分。
4.如果組織樣品本身非常細(xì)小,可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解,通過強(qiáng)烈Vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清,用于后續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便,不必使用勻漿器,缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。
5.溶解NobleRyder RIPA Lysis Buffer時,應(yīng)盡量縮短溶解時間,避免有效成分失效。
6.裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物,屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。在不檢測和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下,可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗;如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白,7.則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物,隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子,例如NF-KB、p53等時,通常不必進(jìn)行超聲處理,就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。
8.細(xì)胞裂解的操作步驟,應(yīng)置于冰上或4℃進(jìn)行。
有效期: 12個月有效。
NobleRyder RIPA裂解液(中)