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NobleRyder RIPA裂解液(強(qiáng),無抑制劑)

  • 型   號:P4833
  • 價   格:
  • 更新時間:2024-09-26
  • 廠家性質(zhì):經(jīng)銷商

NobleRyder RIPA裂解液(強(qiáng),無抑制劑) 即用型液體試劑 P4833-100ml

NobleRyder RIPA裂解液(強(qiáng),無抑制劑) 

產(chǎn)品簡介:

   多種成分均可以從細(xì)胞中提取總蛋白,例如Triton、SDS、NP-40等。RIPA裂解液(強(qiáng))(Enhanced RIPA lysis buffer ,without inhibitors)是采用一種經(jīng)典的細(xì)胞組織快速裂解,并獲得總蛋白的裂解液,其裂解強(qiáng)度大于NP-40裂解液、RIPA裂解液(中)。所獲得的蛋白質(zhì)可以用于Western,免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)等。

    Enhanced RIPA lysis buffer without inhibitors 主要由Tris、NP-40、sodium deoxycholate等組成,不含蛋白酶和磷酸酶抑制劑,并維持原有的蛋白間相互作用。

產(chǎn)品組成: 

編號

名稱

P4833

Storage

Enhanced RIPA lysis buffer without inhibitors

100ml

-20℃

使用說明書

1份

 

 

操作步驟(僅供參考): 

(一)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

1、取Enhanced RIPA lysis buffer室溫溶解混勻,根據(jù)需要選擇添加或不添加抑制劑。

2、去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液,用PBS、NS或無血清培養(yǎng)液清洗1次,低速離心,棄上清,留取沉淀。

3、按照 6 孔板每孔加入150~250μl含有PMSF的裂解液的比例, 加入 RIPA Lysis Buffer  。移液器輕輕吹打,使裂解液和細(xì)胞充分接觸。置于冰上或4℃裂解15~30min,通常裂解液作用于細(xì)胞 1~3 秒內(nèi),細(xì)胞就會被裂解。通常 6 孔板每孔細(xì)胞加入 150μl裂解液已經(jīng)足夠,但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200~250μl。

4、10000~12000g,4℃離心5~10min(如無低溫離心機(jī),室溫下離心亦可),取上清。

5、進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

1、取 Enhanced RIPA Lysis Buffer室溫溶解混勻,根據(jù)需要選擇添加或不添加抑制劑。

2、低速離心懸浮細(xì)胞,棄上清,收集沉淀。

3、用手指輕彈細(xì)胞,使其松散。按照 6 孔板每孔細(xì)胞加入 150~250μl裂解液的比例,加入 Enhanced  RIPA Lysis Buffer。通常 6 孔板每孔細(xì)胞加入 150μl裂解液已經(jīng)足夠,但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到 200~250μl。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞,充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。

4、 10000~12000g,4℃離心 5~10min(如無低溫離心機(jī),室溫下離心亦可),取上清。

5、  進(jìn)行后續(xù)的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(三)組織樣本

1、取 Enhanced Lysis Buffer  置于室溫溶解混勻,根據(jù)需要選擇添加或不添加抑制劑。

2、把組織jian切成細(xì)小的碎片,越小越好。取在液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min 以上的組織,迅速用液氮研磨,研磨過程盡量控制在1~2min 之內(nèi),以減少蛋白的降解。

3、按照每20mg組織加入 150~250μl 裂解液的比例加入含有 PMSF 的裂解液。冰上或 4℃裂解 15-30min。

4、步驟 3、4 亦可以采用如下過程:按照每 20mg 組織加入 150~250μl 裂解液的比例加入含有 PMSF 的 Enhanced  RIPA Lysis Buffer。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿,直至充分裂解,該過程盡量控制在 1~2min 之內(nèi),以減少蛋白的降解。

5、10000~12000g,4℃離心 5~10min(如無低溫離心機(jī),室溫下離心亦可),取上清。

6、進(jìn)行后續(xù)的 PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事項:

1、去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液后,如果血清中的蛋白沒有干擾,可以不用清洗。

2、如果裂解不充分可以適當(dāng)增加裂解液的用量,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當(dāng)減少裂解液的用量。

3、如果細(xì)胞量較多,必需分裝成 50~100 萬細(xì)胞/離心管,然后再裂解。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分,而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸,相對比較容易裂解充分。

4、如果組織樣品本身非常細(xì)小,可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解,通過強(qiáng)烈 Vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清,用于后續(xù)實(shí)驗。

5、溶解RIPA Lysis Buffer 時,應(yīng)盡量縮短溶解時間,避免有效成分失效。

6、裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物,屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA 等的復(fù)合物。在不檢測和基因組 DNA 結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下,可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗;如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白,則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物,隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子,例如 NF-KB、p53 等時,通常不必進(jìn)行超聲處理,就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。

7、  細(xì)胞裂解的操作步驟,應(yīng)置于冰上或 4℃進(jìn)行。 

有效期:12個月有效。

NobleRyder RIPA裂解液(強(qiáng),無抑制劑) 

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